β-酪蛋白

β-酪蛋白(β-CN)广泛存在于哺乳动物(牛、牦牛、山羊、马、兔等)和人的乳汁中,是由乳腺腺泡上皮细胞合成的磷酸化蛋白质。

β-CN在人初乳中的含量为 0.26 mg/100 mL,在成熟乳中含量为 0.3-0.5 mg/100 mL,占总酪蛋白含量的 50 % ~ 85 %。人乳中的酪蛋白为总蛋白质的 30 %~35 %左右,主要是 β-酪蛋白和 κ-酪蛋白,其中β-酪蛋白所占比例较大。不同泌乳阶段,酪蛋白的组成并不完全相同,如人乳中的 κ-酪蛋白只能在产后 3-4 天检测到。

β-酪蛋白(β-CN)是由乳腺腺泡上皮细胞合成的磷酸化蛋白质,广泛存在于哺乳动物(牛、牦牛、山羊、马、兔等)和人的乳汁中。

β-酪蛋白(β-CN)家族至少能在七种哺乳亚纲和两种有袋动物中找到,其蛋白质的氨基酸序列和核酸序列已被我们所知。人乳中级结构已用埃德曼降解法确定,其序列与牛乳和羊乳蛋白序列比较,显示有 50 %是相同的,序列数据也暗示着其基因的多态性。由于 β-CN 是人乳酪蛋白中主要的蛋白质成分,因此有研究者认为在婴儿配方乳粉中强化 β-CN,可以使牛乳更接近人乳,从而缩小了牛乳喂养与母乳喂养的差距。另外,婴儿使用强化了 β-CN 的婴儿配方乳粉,可有效提高整体配方奶粉的易消化性。

β-CN 由 226 个氨基酸残基组成,分子量为 25 382 Da。β-酪蛋白含有大量的谷氨酰胺,此氨基酸序列是非常保守的,在N-末端附近形成了主要的磷酸化作用位点,β-酪蛋白磷酸化位点的数量和磷酸化水平比α-酪蛋白少。在牛的β-酪蛋白中,一个完全磷酸化形式包含5个磷酸基团,而在其他物种里,β-酪蛋白含有大量的磷酸化作用形式,如人、山羊和负鼠。Sood 比较了在 β-酪蛋白中含量较高的结合了两个磷酸根的 β-酪蛋白(β-CN-2P)和结合了四个磷酸根的 β-酪蛋白(β-CN-4P),结果显示两者约占 β-酪蛋白总量的70%,每个大约35 %。在 β-酪蛋白中脯氨酰基(Proly-)有相当高的频率,因其实亚氨基酸,形成肽键后,不能参与氢键的形成,加上其 α-碳原子位于五元环上,两侧的键难于旋转,不易形成 α-螺旋(α-Helix),故脯氨酸是倾向于瓦解 α-螺旋和 β-片层结构(β-Pleated sheetstructure)的。

β-酪蛋白是人乳中的主要蛋白质,是一种磷酸化蛋白。蛋白质的磷酸化区域可与钙离子结合,并且磷酸化程度越高结合钙离子能力越强。据推测,人乳β-酪蛋白的磷酸化位点以及数量与酪蛋白和钙离子结合数量等相关,也影响其他二价离子如锌的吸收。在消化过程中,磷酸化的β-酪蛋白被降解成多种具有生物活性的肽段,并能够引起行为、消化代谢、激素、免疫、神经和营养等多方面的应答。钙离子与酪蛋白结合形成胶束,这使得它能更好地被婴儿吸收。有研究表明β-酪蛋白能够大大降低过敏性,并且它能够影响新生儿的睡眠模式。除了具有非常优秀的消化性,以及低过敏性之外还有其他的一些功能,比如β-酪蛋白具有抗高血压的功能,因为它在消化过程中可以施放出抗高血压的生物活性肽,它还有抗病毒的功能;具有抗菌性,能够抑制细菌的生长,同时β-酪蛋白可以防止活性蛋白变异,亦可以促进某些营养成分(如钙、磷、必需氨基酸等)吸收。

蛋白质的分离纯化可根据蛋白质分子的大小、电荷量、溶解度以及亲和性结合部位的有无,建立许多分离纯化的方法。常用的有离心分离、沉淀分离、透析法、超滤法、层析分离、膜分离以及酶法分离等。这些分离纯化蛋白质的方法各有利弊。

离心分离是利用不同物质之间的沉降系数或浮力密度等差异,用离心力场进行的一项分离、浓缩或提炼的物理分离分析技术。

沉淀分离是使用最广泛的酪蛋白组分分离技术,它主要是利用各酪蛋白组分在不同浓度溶液中的溶解性以及对温度、离子强度以及钙离子的敏感性差异而实现分离。根据酪蛋白组分在不同浓度尿素溶液中的溶解度差异,Hipp 等人于 1952 年首次实现了对牛乳 β-CN 和α-CN(包括 αs-CN 和 к-CN)分离,得率分别为 8 %和 45 %。Aschaffenburg等人于 1963 年结合等电点沉淀与尿素沉淀,对 Hipp 的方法进行了改进实验,获得了纯度更高的β-酪蛋白。

层析法又称色谱法,是一种物理化学分离分析方法,是利用混合物中各组分物理化学性质差异,使各组分不同程度分布在固定相和流动相中,由于各组分受力不同从而使各组分以不同速度移动达到分离。用于酪蛋白组分纯化分离的色谱技术主要有离子交换色谱,疏水层析,吸附色谱,凝胶色谱,共价色谱以及亲和色谱等。Thompson 于 1966 年使用 DEAE-纤维素,用 pH=7 的含巯基乙醇和尿素的缓冲液,采用氯化钠进行梯度洗脱,成功分离出酪蛋白组分。Bramanti 等人于 2001 年,使用苯基分离了牛奶蛋白质,蛋白样品用 4 mol 硫氰酸胍进行处理,在 30 min 内从高盐浓度的缓冲液(pH =7.2,含 1.8 mol 硫酸铵和 8 mol 尿素的 0.1mol 磷酸缓冲液)线性降低为低盐浓度的缓冲液状态(含 8 mol 尿素的磷酸缓冲液),实现了对 as-酪蛋白,β-酪蛋白和 к-CN 的分离。

酶是一种生物催化剂,能通过改变反应的活化而加快或降低反应速度,它本身不参与反应,不改变反应的平衡点,因其具有高效性、转移性、温和性等特点,被广泛应用与食品工业中。Huppertz 等人利用 β-酪蛋白和 αs-酪蛋白在低温的酸性条件下溶解度的不同,于 2005 年使用凝乳酶实现了对 β-酪蛋白的富集分离。

膜分离是根据生物膜对物质选择性通透的原理所设计的一种对包含不同组分的混合样品进行分离的方法。膜分离技术具有分离、纯化、精制以及浓缩蛋白的功能,既高效环保又易于操作,已成为一种重要的分离技术,并广泛应用于食品药品、生命科学、化工冶金等重要领域,具有很高的社会效益和经济效益。Agronomique 等人于 1986 年应用微滤技术生产了 β-酪蛋白。Akgol 于 2008 年,用聚酰胺纤维膜和活性绿-4B 染料制成亲和膜,在 pH=5 条件下吸附初步纯化的 β-酪蛋白,之后用含 1.0 mol 氯化钠或含 0.5 mol 硫氰酸钠的 Tris-HC1 缓冲溶液进行梯度洗脱,成功获得了纯度更高的 β-酪蛋白。

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