p53基因

p53基因,人体抑癌基因。该基因编码一种分子量为43.7KDa的蛋白质,但因蛋白条带出现在Marker所示53KDa处,命名为P53。因为蛋白中含有大量的脯氨酸,电泳速度被拖慢。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。mdm2 突变 与 P53突变不共存,p53是一个重要的抗癌基因,其野生型使癌细胞凋亡,从而防止癌变;还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。p53的突变型会提高癌变。

p53是一种肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)。在所有恶性肿瘤中,50%以上会出现该基因的突变。由这种基因编码的蛋白质(protein)是一种转录因子(transcriptional factor),其控制着细胞周期的启动。许多有关细胞健康的信号向p53蛋白发送。关于是否开始细胞分裂就由这个蛋白决定。如果这个细胞受损,又不能得到修复,则p53蛋白将参与启动过程,使这个细胞在细胞凋亡(apoptosis)中死去。有p53缺陷的细胞没有这种控制,甚至在不利条件下继续分裂。像所有其它肿瘤抑制因子一样,p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。 细胞中抑制癌变的基因“p53”会判断DNA变异的程度,如果变异较小,这种基因就促使细胞自我修复,若DNA变异较大,“p53”就诱导细胞凋亡。

p53是重要的肿瘤抑制基因,自从该基因在1979年被首次报道以来,有关研究论文在Medline上可查到20000余篇。人们最初认为p53基因是一种癌基因,但随着近十年研究的深入,p53作为抑癌基因的功能逐渐被揭示出来。在人类50%以上的肿瘤组织中均发现了p53基因的突变,这是肿瘤中最常见的遗传学改变,说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。

p53基因突变后,由于其空间构象发生改变,失去了对细胞生长、凋亡和DNA 修复的调控作用,p53基因由抑癌基因转变为癌基因。

p53介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用,它与细胞内其它信号转导通路间的联系十分复杂,其中p53参与调控的基因已超过160种,因此,Levine 等学者提出了p53基因网络的概念:

他们认为不能孤立地观察各个基因的生物学功能,而应该将它们组合起来看待。

p53蛋白主要分布于细胞核浆,能与DNA特异结合,其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控。正常p53的生物功能好似“基因组卫士(guardian of the genome)”,在G1期检查DNA损伤点,监视基因组的完整性。如有损伤,p53蛋白阻止DNA复制,以提供足够的时间使损伤DNA修复;如果修复失败,p53蛋白则引发细胞凋亡;如果p53基因的两个拷贝都发生了突变,对细胞的增殖失去控制,导致细胞癌变。

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,在短短的十多年里,人们对 p53基因的认识经历了癌蛋白抗原,癌基因到抑癌基因的三个认识转变,现已认识到,引起肿瘤形成或细胞转化的p53蛋白是p53基因突变的产物,是一种肿瘤促进因子,它可以消除正常p53的功能,而野生型P53基因是一种抑癌基因,它的失活对肿瘤形成起重要作用。p53蛋白还分布于线粒体、核仁等结构,并且与细胞骨架有相互作用关系。

P53基因在人类、猴、鸡和鼠等动物中相继发现后,对其进行了基因定位,人类 P53基因定位于17P13,鼠P53定位于11号染色体,并在14号染色体上发现无功能的假基因,进化程度迥异的动物中,P53有异常相似的基因结构,约20Kb长,都由11个 外显子和10个内含子组成,第1个外显子不编码,外显子2、4、5、7、8、分别编码5 个进化上高度保守的结构域,P53基因5个高度保守区即第13~19、117~142、171~19 2、236~258、270~286编码区.P53基因转录成2.5KbmRNA,编码393个氨基酸蛋白, 分子量为43.7KD,P53基因的表达至少受转录及转录后二种水平的调控.在停止生长或非 转化细胞中P53mRNA水平很低,但刺激胞液后mRNA显著增加.持续生长的细胞,其mRNA 水平不随细胞周期而出现明显变化,但经诱导分化后mRNA水平降低,部分是转录后调 控.P53基因的转录由P1、P2二个启动子控制.P1启动子位于第一外显子上游100~250bp, P2位于第一内含子内,在启动子中包含1个NF1蛋白结合位点和一个转录因子AP1相关 蛋白的结合位点,对正常P53基因的转录,不仅需要二个启动子的平衡作用,而且P53 基因内含子也起作用,如内含子中有正调控作用,其调控有组织特异性. P53 基因位于人类17号染色体含11 个外显子,其转录翻译编码的野生型P53 蛋白由393个氨基酸残基组成,包含多个功能域。N-末端的转录激活结构域(activtiondomain, AD)AD1,AD2位于氨基酸1-50位,与通用转录因子TF11D 结合而发挥转录激活功能。TF11D 是由TBP(TATAbinding protain)和TAF(TBP associatedfactor)结合而成的复合物,P53与TF11D中的TAF结合,作用于下游基因启动子中的TATA box ,达到转录激活功能。P53基因生长抑制结构域位于氨基酸65-90 位,富含脯氨酸,含5重复的pxxp序列,可与含SH3 结构域的蛋白质相互作用,将P53与信息传递途径连接起来。

P53 基因还有:序列特异的DNA结合结构域,位于氨基酸100-300位间;核定位信号NLS位于氨基酸残基316-325;四聚体寡聚化结构域,定位于氨基酸残基334-356;C-末端非专一DNA调节结构域,同时在碰到DNA损伤时,P53 可能补充其它蛋白质到损伤部位,提供DNA损伤信号。P53 与DNA的结合能力并非特异性地与DNA 结合,参与核心区与DNA 结合的别构调节,同时在碰到DNA损伤时,P53可能补充其他蛋白质到损伤部位,提供DNA损伤信号。

P53蛋白N一端为酸性区1~80位氨基酸残基,C-端为碱性区319~393位氨基酸残 基,正常的P53蛋白在细胞中易水解,半衰期为20分钟,突变性P53蛋白半衰期为1.4~ 7小时不等,P53蛋白N端有一个与转录因子相似的酸性结构域,与GAL4的DNA结合区重 组时,融合蛋白能激活GAL4操纵子转录,激活功能定位在P53第20~40位密码子,P53 细胞定位及反式激活功能提示,P53蛋白可能直接或通过与其他蛋白作用参与转录控制。

P53蛋白的DNA结合作用及反式激活作用还提示其参与细胞生长调控.通过流式细 胞仪测定单个细胞的细胞周期中P53的表达,发现激活的淋巴细胞比未激活者有较多 的P53表达,而且随细胞从G1至S期再到G2,M期而增加,提示P53表达与细胞生长的相 关性比进入细胞周期或周期中特定时刻为高.以编码反义P53RNA的质粒转染非转化细 胞导致细胞生长完全停止,P53抗体注入将进入生长周期的静止细胞.可抑制细胞入S 期,提示P53可能为Go/G1-S转换所必需,但P53抗体对细胞从分裂至S期无作用,G1期 细胞有抑制作用的二丁酸钠也抑制P53合成,这些结果提示P53对细胞生长调控作用至 少表现在从G0-G1,或G1-S,但其作用机理尚未弄清楚。P53蛋白可通过调控Cipt基因表达而调控细胞生长,即P53蛋白可刺激Cipt基因产生分子量为21KD的蛋 白,这种蛋白能够有效抑制某些促使细胞通过细胞周期进入有丝分裂的酶活性,从而 抑制细胞生长,此外,P53的抑制作用还伴随细胞生长核抗原株表达的降低。细胞生长、核抗原参与细胞DNA复制.因此,P53可能通过抑制与DNA复制相关的细胞基因或基 因产物而发挥作用。

阻滞细胞周期

在细胞周期中,P53 的调节功能主要体现在G1和G2/M 期校正点的监测,与转录激活作用密切相关。P53下游基因P21编码蛋白是一个依赖Cyclin的蛋白激酶抑制剂,一方面P21 可与一系列Cyclin-cdk 复合物结合,抑制相应的蛋白激酶活性,导致Cyclin-cdk无法磷酸化Rb ,非磷酸化状态的Rb保持与E2F的结合,使E2F这一转录调节因子不能活化,引起G1期阻滞;另外P53的另外3个下游基因Cyclin B1,GADD45 和14-3-3σ 则参与G2/M期阻滞。 P53 下调Cyclin B1表达,细胞则不能进入M期GADD45通过抑制Cyclin B1-cdk2复合物的活性发挥作用,14-3-3σ与cdc25c结合,干扰Cyclin B1-cdk2复合物发挥转录调节作用。

促进细胞凋亡

对p53促进细胞凋亡的功能研究进行得比较深入。通过Bax/Bcl2, Fas/Apol,IGF-BP3 等蛋白,p53可完成对细胞凋亡的调控作用。Bcl-2 可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来,具有抗凋亡作用,而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用,介导细胞色素c 的释放,具有凋亡作用,p53可以上调Bax的表达水平,以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用。P53还可通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡,TNF 受体和Fas蛋白。有学者认P53 还可直接刺激线粒体释放高毒性的氧自由基来引发凋亡。

维持基因组稳定

DNA受损后,由于错配修复的累积,导致基因组不稳定,遗传信息发生改变。P53可参与DNA的修复过程,其DNA结合结构域本身具有核酸内切酶的活性,可切除错配核苷酸,结合并调节核苷酸内切修复因子XPB 和XPD的活性,影响其DNA重组和修复功能。P53还可通过与P21 和GADD45形成复合物,利用自身的3’-5’核酸外切酶活性,在DNA修复中发挥作用。

抑制肿瘤血管生成

肿瘤生长到一定程度后,可以通过自分泌途径形成促血管生成因子,刺激营养血管在瘤体实质内增生。P53蛋白能刺激抑制血管生成基因Smad4 等表达,抑制肿瘤血管形成。在肿瘤进展阶段,P53基因突变导致新生血管生成,有利于肿瘤的快速生长,常是肿瘤进入晚期的表现。

P53蛋白与其它蛋白的相互作用,P53基因突变,都可以导致正常生物功能的丧失。

P53与蛋白质的相互作用

一些蛋白质能与P53蛋白作用,导致其正常生物学功能的丧失,DNA肿瘤病毒如 HPV16、18、SV40和腺病毒编码癌蛋白,引起宿主细胞的恶性病变,这些癌蛋白如 SV40T抗原、腺病毒ELa、ELb、HPVE6能与Rb,P53结合.Scheffner证实,HPVE6结合 P53后,启动细胞内蛋白酶降解P53,从而降低P53正常功能.而SV40T,腺病毒ELb没有 发现这种降解作用方式.此外,P53还可以被细胞基因产物相互作用而失活,如MDM2可 结合P53而使其失活,在一些常见的人类肉瘤中,都有MDM2基因扩增,这种扩增可能干扰P53的正常功能。

P53基因突变

P53正常功能的丧失,最主要的方式是基因突变,通过肿瘤中大量的突变体分 析,证实大部分突变是位于4个突变热点之一的错义突变.这4个突变热点是aa129~146、 171~179、234~260、270~287:正对应于P53基因进化最保守区段,体外实验证实突 变体失去特异位点的结合能力,此外,突变体还可以改变P53的球形构象.例如,一些 突变体可与热休克蛋白结合,一些突变引起213~217肽段的暴露,另外,一些则引起 酸性激活结构域的改变,这些突变提示P53的微小改变可引起远离突变位点区段甚至 整个蛋白构象的改变.构象的改变不仅影响突变体,还影响野生型的功能.实验证明, 野生型突变体组成的四聚体不能与结合位点结合,也丧失对目的基因的方式激活作 用,突变体对野生型的结合失活.可以解释内源野生型P53的负调控作用的解除,从而 引起细胞恶性病变,随着研究的深入,对P53突变有了新的认识,Dan等认为肿瘤中 P53突变可分为三类:①零突变:即突变体无功能,不参与相互作用;②负突变:即失去 负调控功能,并能使野生型失活,但并不直接参与致癌;③正突变:失去负调控功能, 并获得转化能力,这种突变体可直细胞恶性转化中代替癌基因起启动作用。

P53失活机理是野生型P53以四聚体形式与特异位点结合,反式激活 下游生长抑制基因的表达,一系列的方式能使P53失活,在一些肿瘤中,单一或两个 P53位点的丧失降低四聚体浓度,无义突变造成P53翻译中断,C端酸性结构域的丢失 影响四聚体形成;最常见的是错义突变,野生型与突变体形成更稳定的四聚体,丧失 正常功能。

P53基因与人类50%的肿瘤有关,有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨 肉瘤等,人类肿瘤中P53突变主要在高度保守区内,以175、248、249、273、282位点 突变最高,不同种类肿瘤不同,如结肠癌和乳腺癌有相似的流行病学(包括地区分布 和危险因素),但P53突变谱并不一致.结肠癌G:CA:T转换占79%,而且多数CpG,二核 苷酸位点,50%以上转换突变发生在第3~5结构域的CpGC位于码子175、248、273);在 乳腺癌中,只发现13%的转换在CpG位点.此外,G-T颠换在乳腺癌占1/4,但在结肠癌T 分罕见.淋巴瘤和白血病的P53,突变方式与结肠癌相似,即大部分突变为CPG位点的 转换,G→T颠换较低,A:T→G:C在A:T位点突变较高.佰基特淋巴瘤与其它B细胞淋巴 瘤和T淋巴细胞恶性病变的P53突变谱相似,但佰基特淋巴瘤的转换突变较高.在非小 细胞肺癌中G:C→T:A最普遍,食道癌颠换率很高,与肺癌不同的是,G:C和A:T位点有 相似的突变率.我国启东地区50%为249癌码子的G→C、G→T颠换,而南非肝癌80%为G→T 颠换.骨肉瘤中P53突变率为75%,主要集中在5~9外显子。

简介

基因治疗是指以改变人类遗传物质为基础的生物医学治疗。是通过一定方式将人的正常基因或有治疗作用的DNA顺序导入人体靶细胞,去纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。因此基因治疗针对的是疾病的根源—异常的基因本身。

癌症是一种基因病,是人体细胞在外环境因素作用下,内在多种前癌基因被激活和抑癌基因失活的多阶段长期演变的过程。癌症是严重威胁人类健康和生命的杀手,我国每年新发癌症患者250万以上,每年在治患者不下600万,治疗费用超过1500亿元。肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗,尽管医学家们不断完善这3大治疗手段,但许多癌症患者仍然难以得到治愈。人们越来越关注通过“治本”的方法来提高肿瘤治愈率,基因治疗是21世纪人类攻克肿瘤的必由之路。

作用

p53基因是研究最透彻,功能最强大的一种抑癌基因。野生型p53对细胞周期和凋亡起关键性作用,尤其是对受照射、细胞毒制剂、热疗打击的癌细胞,起更大的杀伤作用。其主要作用为:

抑制并杀灭肿瘤细胞;与放、化疗手段协同,增强其杀灭癌细胞的功效,达到

1+1大于2的效果;

抑制肿瘤血管生成,有效防止肿瘤的复发、转移。提高人体自身的免疫功能;

国产的重组人p53腺病毒注射液(商品名今又生),经过5年艰苦的临床试验,由北京肿瘤医院张珊文教授带领放疗科医护人员,在Ⅰ期临床安全性试验完成的基础上,又顺利完成了头颈鳞癌的Ⅱ期临床试验,充分证实对治疗头颈鳞癌是安全有效的。2003年10月16日,国家食品药品监督管理局批准重组人p53腺病毒注射液新药证书,意味着世界上第一个癌症基因治疗药物在中国诞生,标志着我国基因治疗癌症临床和基因药物产业化方面都走在世界前列。

前景

重组人p53腺病毒是一种基因工程改造过的活病毒,在结构上由两部分组成:一是抑癌基因p53,二是载体。载体是改造过的无复制能力的腺病毒。就像火箭携带卫星上太空一样,这种携带p53的腺病毒特异感染肿瘤细胞,它能有效地将治病的p53基因转入肿瘤细胞内,而对正常细胞无害。

今又生结合放疗治疗53例头颈鳞癌,肿瘤完全消失率比单纯放疗的46例提高2倍。结合放疗治疗45例鼻咽癌,肿瘤完全消失率比单纯放疗的41例提高1.7倍。结合放疗治疗了4例不能手术的Ⅲ期子宫颈癌都达到肿瘤完全消失。结合放疗、化疗或热疗治疗各种软组织肉瘤、消化系统腺癌、卵巢癌都取得一定的疗效,而这些病例都是经3大手段治疗失败的病人。使用今又生治疗恶性肿瘤,除出现暂时性自限性发烧外,未发现其他毒副反应。今后,全面的临床试验将在其他三级甲等医院有序展开,p53基因治疗已从实验室走向临床,走向产业化。

p53基因治疗肿瘤只是开了一个好头,为人类征服癌症带来了新的希望和曙光

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