极端酶

极端酶是由能在极端环境下生长的微生物(极端微生物,又称嗜极菌)产生的,能够在极端环境下行使功能的酶。极端酶能在各种极端环境中起生物催化作用,它是极端微生物在极其恶劣环境中生存和繁衍的基础 ,根据极端酶所耐受的环境条件不同,可分为嗜热酶、嗜冷酶、嗜盐酶 、嗜碱酶、嗜酸酶、嗜压酶、耐有机溶剂酶、抗代谢物酶及耐重金属酶等。大力拓展酶的应用空间,是建立高效率、低成本生物技术加工过程的基础,例如PCR技术中的Tag DNA聚合酶、洗涤剂中的碱性酶等都具有代表意义。极端微生物的研究与应用将是取得现代生物技术优势的重要途径,其在新酶、新药开发及环境整治方面潜力极大。

嗜极菌是天然极端酶的主要来源,生活在生命边缘(高温温泉、海底、南北极、碱湖和死海等)的嗜极菌,包括嗜热菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜盐菌、嗜冷菌、嗜压菌和耐有机溶媒的菌类,体内需要有适应于生存环境的基因、蛋白质和酶类。因此从嗜极菌中可以筛选人们所需要的极端酶。在美国、日本、德国等地有20多个研究课题组正活跃于寻找嗜极菌及极端酶。按常规的极端酶筛选方法:从极端环境中采集样品,富集,分离嗜极菌,再通过特定选择标记筛选极端酶。用这种方法已经分离得到很多极端酶。但是人们对环境的认识仍有限,实际上大部分的嗜极菌还未被培养,因此限制了极端酶的开发。1994 年美国RBI公司(Recoinbinant Bio-catalysis Inc.)直接从极端环境中收集DNA样品,随机切割成限制性片段,再插入寄主细胞(E.coli 或 Bacterium等)进行表达,并筛选极端酶,RBI公司利用此法已经获得175种新的极端酶,大大节省时间和金钱,提高了极端酶的筛选效率。

一旦筛选得到极端酶的生产菌株,要使极端酶投入工业化应用,接着就是大规模的细胞培养和酶的大量合成及分泌条件的优化,生化反应设备的设计等工作。因此,各种超高温生化反应器,高静压生化反应器应运而生。尽管如此,要满足嗜极菌的生长及发酵条件,将会对设备和环境提出苛刻的要求,设备腐蚀和破坏率大大提高。为了解决这一难题,科学家把极端酶的基因克隆到嗜温菌中表达。嗜碱纤维素酶103的基因被克隆到芽孢杆菌中获得成功表达,产物能很好地保持原有的稳定性,成果被应用在工业化生产,并在洗涤剂工业中使用,每年产量50-250吨。

人们从嗜热菌中已分离得到多种嗜热酶(55-80℃)及超嗜热酶(80-113℃),包括淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶及DNA聚合酶等,在75-100℃之间具有良好的热稳定性。同种嗜热酶与嗜中温酶主要性质基本相同,热稳定性不同主要是分子内部结构决定的,维持其内部立体结构的化学键和物理键,特别是氢键、二硫键的存在及数量与酶的热稳定性有关。一般认为,当这些键存在及数量增加时,酶的热稳定性增强;这些键断开,则酶的热稳定性降低或丧失。分子量较小的蛋白质一般比分子量较大的蛋白质有更大的热稳定性。例如嗜热栖热菌的3-磷酸甘油脱氢酶分子量就较小,利于热稳定。在芽孢形成过程中,由于芽孢杆菌的醛缩酶分子中有一部分与酶活性无多大关系的肽链被水解掉,从而使该酶的热稳定性提高。嗜热酶分子的许多微妙结构很可能与热稳定性有关,例如稍长的螺旋结构、三股链组成的β-折叠结构、C和N端氨基酸残基间的离子作用以及较小的表面环等形成了嗜热酶紧密而有韧性的空间结构,提高了热稳定性。高温谷氨酸脱氢酶和柠檬酸合成酶的结构研究表明了离子作用在嗜热酶中的重要性,嗜热酶在离子偶联的数量和程度上胜过嗜温酶,而且柠檬酸合成酶嗜热酶还包括亚单位的相互作用和羧基端氨基酸残基的作用。但是,高温稳定性和离子相互作用的正比关系并不是普遍存在的。Ca能提高许多热稳定性酶的耐热性,起到类似二硫键样的桥连接作用,对稳定酶分子的三维结构有重要作用;锌离子对某些耐热酶也有热稳定作用,把嗜热脂肪芽孢杆菌编码腺苷酸激酶的基因转染给的大肠杆菌,分析所表达的蛋白质,可发现该腺苷酸激酶含有1个与4个半胱氨酸紧密结合的锌离子,形成1个锌指结构。如果用PMPS或者EDTA去除结合状态的锌离子,那么该酶的变性温度从74.5℃降至约67℃。至于后者温度仍然比较高,是由于酶中存在大量的Arg和Lys残基。嗜热和超嗜热的产甲烷菌体内的钾离子和三阴离子环状二磷酸甘油酯的浓度分别达到1.0-2.3 mol/L 和1.2 mol/L,这些含碳化合物对相应的离体酶具有稳定作用。

从嗜热菌中分离出来的酶显示了独特性:具有极高的热稳定性,能抵抗化学变性剂如表面活性剂、有机溶剂和高酸高碱环境,其催化功能优于在各种工业生产中应用的酶。超嗜热菌中存在一种逆促旋酶,它能够诱导DNA形成正性超螺旋的typeI-5′拓扑异构酶。高热稳定的淀粉酶用于生产葡萄糖和果糖,对改进工业淀粉转化工艺非常有意义。已从嗜热Thermotoga 中分离出一种超级嗜热的木糖异构酶,这种酶能把葡萄糖转化为果糖,这样就能在高温条件下提高果糖的产量。一种高热稳定普鲁兰酶能专一水解支链淀粉形成长链线性多糖;木糖酶用于纸张漂白;蛋白酶用于氨基酸生产、食品加工、洗涤剂、固定化制造天冬甜精;纤维素酶用于钻探操作、促进石油或天然气流入油井孔 。嗜热菌有相对高的生长率 ,代谢快,世代时间短,酶的热稳定性高,用于微生物发酵工程可减少污染、节约能量、降低成本、提高处理效果和产品质量。

从嗜冷微生物中分离的嗜冷酶具有低温活性并且在常温下失活。例如来自南极细菌的α-淀粉酶,枯草杆菌蛋白酶和磷酸丙糖异构酶等。通过对嗜冷酶的蛋白质模型和X-射线衍射分析的结果表明,酶分子间的作用力减弱,与溶剂的作用加强,使具有比常温同工酶更柔软的结构,使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用,温度提高,嗜冷酶的弱键容易被破坏,变性失活。对具有低温活性的柠檬酸合成酶结构分析表明,其活性部位的柔软性来自于酶扩展的表面电荷环和酶表面上脯氨酸残基的减少。嗜冷菌分泌的低温葡聚糖酶催化亚基上较小的氨基酸可以增加酶的柔韧性,活性与溶液的离子强度有关。较柔软的活性中心可以更容易地进入底物,进行酶反应。另外嗜冷酶也必须进行结构调整以避免蛋白质的低温变性,通常是通过减少低温下的疏水相互作用。嗜冷菌编码具有低温活性酶的基因也已经成功地表达,在0-2 ℃范围内产α-淀粉酶的嗜冷菌的酶基因已经在大肠杆菌中表达,发现大肠杆菌必须在低于室温的条件下培养,才可使酶正确折叠,避免酶的不可逆变性。

嗜冷菌在低温下即可对污染物质进行降解和转化,分离自嗜冷菌的脂酶、蛋白酶及β-半乳糖苷酶在食品工业和洗涤剂中具有很大潜力。嗜冷碱性蛋白酶应用于洗涤剂工业,可能改变传统的热水洗涤方式,节约能源。嗜冷乳糖酶和淀粉酶为乳品和淀粉加工提供了新的工艺,对保持食品营养和风味起着重要作用,低温发酵也可生产许多风味食品及减少中温菌的污染。从海洋冷适应的微生物中分离的生物活性物质可用于医药、食品等。生命起源于温度很低的海洋,有人提出冷适应的微生物与生命起源相联系。

嗜盐酶多存在于中度嗜盐的古细菌和极度嗜盐的真菌中,从嗜盐微生物中分离的极端酶可以在很高的离子强度下保持稳定性和活性,这对菌体的生长是极为重要的。氨基酸序列的分析比较表明嗜盐酶蛋白质比普通的同工酶含酸性氨基酸更多,过量的酸性氨基酸残基在蛋白表面与溶液中的阳离子形成离子对,对整个蛋白形成负电屏蔽,促进蛋白在高盐环境中的稳定。X 射线晶体和同源性模拟分析揭示的三维结构表明这些酶的表面带负电荷的氨基酸,可以结合大量水合离子,形成一个水合层,减少它们表面的疏水性,减少在高盐浓度下的聚合趋势。蛋白表面具有超额的负电荷是嗜盐蛋白的一个显著特性。

嗜盐菌利用的碳源十分广泛,其中包括难降解的有机物,加之其对渗透压的调节能力较强,体内嗜盐酶的适应能力较强,故将其应用于海产品、酱制品及化工、制药、石油发酵等工业部门排放的含高浓度无机盐废水以及海水淡化等。海藻嗜盐氧化酶在催化结合卤素进入海藻体内代谢中起重要作用,对化学工业的卤化过程有潜在的价值。同时还具有可利用的胞外核酸酶、淀粉酶、木聚糖酶等。有的菌体内类胡萝卜素、γ-亚油酸等成分含量较高,可用于食品工业;有的菌体能大量积累PHB,用于可降解生物材料的开发。

极端嗜碱微生物菌体内部的pH值接近中性,但是其胞外酶必须在极高的pH值环境中保持稳定和活力。嗜碱酶中碱性氨基酸的比率较高,尤其在分子表面,利于酶的稳定。日本报道了一种丝氨酸蛋白酶,在最适pH13的情况,可能是含酸性氨基酸少,而精氨酸与赖氨酸的比率高,在较高pH条件下酶本身仍带静电荷,从而具有稳定性 。嗜碱菌纤维素酶103的基因克隆到芽孢杆菌中获得成功表达,产物能很好地保持原有的稳定性。其它木聚糖酶、淀粉酶、环状糊精葡萄糖基转移酶、β-甘露聚糖酶等也能在中性细菌中加以克隆和表达。

嗜碱菌的胞外酶具耐高碱特性,可用于工业酶制剂生产,有降解天然多聚物的能力,用于处理碱性工业污水,将碱性纸浆废液转化为单细胞蛋白。其淀粉酶可用于纺织品退浆及淀粉作粘接剂时的粘度调节剂。

嗜酸菌分泌的胞外酶往往是相应的嗜酸酶。嗜酸菌不能在中性环境生长,可能是由于嗜酸菌细胞含较多酸性氨基酸,有大量H环境,在中性pH时H大量减少,以致造成细胞溶解。与中性酶相比,嗜酸酶在酸性环境的稳定性是由于酶分子所含的酸性氨基酸的比率高,尤其在酶分子表面。

嗜酸菌已广泛用于低品位矿生物沥滤回收贵重金属、硫氢化酶系参于原煤脱硫及环境保护等方面。

相关词汇

嗜极菌
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